С использованием масс-спектрометрии MALDI TOF/TOF идентифицированы сайты гидролиза белков β-литической металлопротеиназой выделенной из бактерий Lysobacter capsici, штамм ВКМ 2533Т и определена молекулярная специфичность этого фермента. Анализ продуктов гидролиза восьми белков (миоглобина, трех цепей казеина, гемоглобина, овальбумина, овомукоида, бычьего сывороточного альбумина и енолазы 2 дрозофилы) позволил выявить специфичность β-литической протеазы Lysobacter capsici к гидролизу пептидных связей по карбоксильным группам глицина, лизина, аланина, фенилаланина, серина, аспарагиновой кислоты, треонина, валина, глутаминовой кислоты, гистидина, аргинина и цистеина. Наиболее часто гидролизуемыми аминокислотами оказались глицин и аланин, что может быть связано с их малыми размерами и высокой доступностью для активного центра фермента. При этом наличие дополнительных сайтов гидролиза, таких как треонин, при гидролизе белков в ПААГ, но не в растворе, указывает на влияние конформации белка на доступность определенных участков для фермента. Сравнение результатов гидролиза белков в растворе и в ПААГ показало, что денатурация белков при электрофорезе может влиять на доступность сайтов гидролиза. Например, при гидролизе миоглобина в геле был обнаружен дополнительный сайт гидролиза по треонину, который отсутствовал при гидролизе в растворе. Это подтверждает, что конформационные изменения белков, вызванные денатурацией, могут существенно влиять на специфичность протеолиза.
масс-спектрометрии MALDI, бактериальная металлопротеаза, гидролиз белков, электрофорез, аминокислоты
1. Александров М.Л., Галь Л.Н., Краснов Н.В. и др. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении — метод масс-спектрометрического анализа биоорганических веществ // ДАН СССР. 1984. Вып. 277. № 2. С. 379–383.
2. Веселовский А.В., Соболев Б.Н., Жаркова М.С., Арчаков А.И. Компьютерные методы предсказания субстратной специфичности цитохромов р450 // Биомедицинская химия. 2010. Вып. 56. № 1. С. 90–100.
3. Константинов М.А., Жданов Д.Д., Торопыгин И.Ю. Количественная масс-спектрометрия с меткой ¹⁸О как альтернативный подход к определению активности протеаз на примере трипсина // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2024. Вып. 24(1). С. 46–60. DOI:https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-1-46-60.
4. Трачук Л.А., Бушуева А.М., Шевелев А.Б. и др. Изучение S1’-кармана первичной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris методом направленного мутагенеза // Биомедицинская химия. 2002. Вып. 48. № 6. С. 577–585.
5. Blombäck B., Blombäck M., Edman P., Hessel B. Human fibrinopeptides isolation, characterization and structure // Biochim. Biophys. Acta. 1966. Vol. 115. № 2. P. 371–396. DOI:https://doi.org/10.1016/0304-4165(66)90437-5.
6. Christensen P., Cook F. Lysobacter, a new genus of nonfruiting, gliding bacteria with a high base ratio // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1978. Vol. 28. P. 367–393.
7. Fenn J.B., Mann M., Meng C.K. et al. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules // Science. 1989. Vol. 246. № 4926. P. 64–71. DOI:https://doi.org/10.1126/science.2675315.
8. Giansanti P., Tsiatsiani L., Low T.Y., Heck A.J.R. Six alternative proteases for mass spectrometry-based proteomics beyond trypsin // Nat. Protoc. 2016. Vol. 11. № 5. P. 993–1006. DOI:https://doi.org/10.1038/nprot.2016.057.
9. Herbert C.G., Johnstone R.A.W. Mass Spectrometry Basics. Boca Raton: CRC PRESS, 2002. 474 p.
10. Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules // Anal. Chem. 1985. Vol. 57. № 14. P. 2935–2939.
11. Linderstrøm-Lang K. Lane Medical Lectures: Proteins and Enzymes. Stanford University Press: Stanford, 1953.
12. Mann M. The Rise of Mass Spectrometry and the Fall of Edman Degradation // Clin. Chem. 2016. Vol. 62. № 1. P. 293–294. DOI:https://doi.org/10.1373/clinchem.2014.237271.
13. Šlechtová T., Gilar M., Kalíková K., Tesařová E. Insight into Trypsin Miscleavage: Comparison of Kinetic Constants of Problematic Peptide Sequences // Anal. Chem. 2015. Vol. 87. № 15. P. 7636–7643. DOI:https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b00866.
14. Tsiatsiani L., Heck A.J.R. Proteomics beyond trypsin // FEBS J. 2015. Vol. 282(14). P. 2612–2626. DOI:https://doi.org/10.1111/febs.13287.
15. Walmsley S.J., Rudnick P.A., Liang Y. et al. Comprehensive analysis of protein digestion using six trypsins reveals the origin of trypsin as a significant source of variability in proteomics // J. Proteome Res. 2013. Vol. 12. P. 5666–5680. DOI:https://doi.org/10.1021/pr400611h.
16. Yamashita M., Fenn J.B. Electrospray ion source. Another variation on the free-jet theme // J. Phys. Chem. 1984. Vol. 88. № 20. P. 4451–4459. DOI:https://doi.org/10.1021/j150664a002.
